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PCR儀|基因擴(kuò)增儀工作原理
2012-06-19
什么是PCR技術(shù)?
PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)，中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外(試管、切片…)擴(kuò)增核酸的技術(shù)。PCR的基本反應(yīng)包括以DNA為模板的反應(yīng)和以mRNA為模板的反應(yīng)。
PCR技術(shù)是模擬體內(nèi)天然DNA(脫氧核糖核酸)的復(fù)制過程。以擴(kuò)增DNA為例，其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。
PCR反應(yīng)擴(kuò)增的過程及原理是怎樣的?
PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個分子)。
PCR反應(yīng)每個循環(huán)的三個基本反應(yīng)步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。
PCR儀也叫基因擴(kuò)增儀，它是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。
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